RAB35 ist für die Entwicklung und Funktion des murinen Hippocampus durch Regulierung der neuronalen Zellverteilung erforderlich

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 440 (2023) Diesen Artikel zitieren

1101 Zugriffe

4 Altmetrisch

Details zu den Metriken

RAB35 ist eine multifunktionale kleine GTPase, die das endozytische Recycling, die Umlagerung des Zytoskeletts und die Zytokinese reguliert. Seine physiologischen Funktionen in der Säugetierentwicklung bleiben jedoch unklar. Hier haben wir Rab35-Knockout-Mäuse erzeugt und herausgefunden, dass RAB35 für die frühe Embryogenese essentiell ist. Interessanterweise zeigten gehirnspezifische Rab35-Knockout-Mäuse schwere Defekte in der Hippocampus-Laminierung aufgrund einer beeinträchtigten Verteilung der Pyramidenneuronen, obwohl Defekte in der Bildung der Großhirnrinde nicht erkennbar waren. Darüber hinaus zeigten Rab35-Knockout-Mäuse Defekte im räumlichen Gedächtnis und angstbezogenes Verhalten. Quantitative Proteomikstudien zeigten, dass der Verlust von RAB35 die Konzentrationen anderer RAB-Proteine, die mit dem endozytischen Transport in Zusammenhang stehen, sowie einige neurale Zelladhäsionsmoleküle wie Contactin-2 erheblich beeinflusste. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass RAB35 für eine präzise neuronale Verteilung im sich entwickelnden Hippocampus erforderlich ist, indem es die Expression von Zelladhäsionsmolekülen reguliert und dadurch das räumliche Gedächtnis beeinflusst.

Die RAB-Proteine ​​bilden die größte Familie kleiner GTPasen, die den intrazellulären Membrantransport in eukaryontischen Zellen regulieren1. Insbesondere RAB35 ist ein hochkonserviertes RAB-Protein in Metazoen und ist im Recycling-Endosom und in der Plasmamembran lokalisiert. RAB35 wurde ursprünglich als Regulator des endozytischen Recyclings entdeckt, das für die Zytokinese in HeLa-Zellen erforderlich ist2,3. Bei Caenorhabditis elegans steuert RAB35 das endozytische Recycling von Dotterrezeptoren, die für das Wachstum und den Zelltod der Eizellen essentiell sind4,5,6. Drosophila RAB35 ist an der Aktinbündelung, Phagozytose, Neurotransmitterfreisetzung und Spermatogenese beteiligt7,8,9,10. Bei Säugetieren reguliert RAB35 zusätzlich zu seiner primären Rolle im Recyclingweg8,11,12,13 mehrere Membrantransportwege, darunter den retrograden Transport von Endosomen zu Golgi, Phagozytose, Exosomensekretion und Autophagie. RAB35 von Säugetieren spielt auch eine Rolle bei mehreren zellulären Prozessen, die mit dynamischen Membranveränderungen verbunden sind, wie Zytokinese, immunologische Synapsenbildung, Myoblastenfusion, Ziliumlänge und Zellmigration, in vielen Arten von Kulturzellen und Primärzellen2,14,15,16, 17,18. Darüber hinaus haben frühere Studien an Drosophila und neuronalen Zelllinien über mehrere Funktionen von RAB35 im Nervensystem berichtet, darunter Neuritenwachstum, Axonverlängerung, Exosomensekretion, Neurotransmitterfreisetzung, Oligodendrozytendifferenzierung und synaptischen Vesikelumsatz9,11,19,20,21, 22. Tatsächlich sind kürzlich Zusammenhänge zwischen RAB35 und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit aufgetaucht23,24. Kürzlich wurde RAB35 auch als onkogenes RAB identifiziert, das die Zellproliferation fördert25. Die physiologische Bedeutung von RAB35 für die Entwicklung von Säugetieren bleibt jedoch weitgehend unbekannt.

Die Bildung des Gehirns von Säugetieren ist ein hochorchestrierter Prozess, der die Erzeugung, Differenzierung, Migration und Reifung von Neuronen umfasst. Die neuronale Migration ist ein wesentlicher Prozess, um die richtige Positionierung von Neuronen sicherzustellen und für die Organisation mehrschichtiger Strukturen, insbesondere der Großhirnrinde und des Hippocampus26. Die Beeinträchtigung dieses Prozesses wirkt sich nachteilig auf neuronale Netzwerke und die Gehirnarchitektur aus und verursacht mehrere neurologische Störungen, darunter Lissenzephalie, Epilepsie und Schizophrenie27,28,29. Der molekulare Mechanismus, der mit der Bildung laminierter Strukturen verbunden ist, wurde hauptsächlich in der Großhirnrinde untersucht. Auf In-utero-Elektroporation basierende Knockdown-Experimente haben gezeigt, dass RAB-Proteine, die mit der Endozytose in Zusammenhang stehen, wie RAB5, RAB7, RAB11, RAB18 und RAB23, die kortikale neuronale Migration in Mäusen regulieren, indem sie den Verkehr von N-Cadherin während der einzelnen Schritte der Endozytose steuern30, 31,32. Obwohl angenommen wird, dass der Bildungsprozess des Hippocampus ähnlich ist, ist sein Entwicklungsmechanismus, einschließlich der Rolle der RAB-Proteine, weniger gut verstanden.

Um die physiologische Funktion von RAB35 bei Säugetieren aufzudecken, haben wir hier systemische Rab35-Knockout-Mäuse erzeugt und festgestellt, dass RAB35 während der frühen Embryogenese von Mäusen essentiell ist. Wir haben auch Rab35-Knockout-Mäuse generiert, die für das Zentralnervensystem (ZNS) spezifisch sind, und RAB35 als Voraussetzung für die ordnungsgemäße Entwicklung des Hippocampus identifiziert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass RAB35 eine wesentliche Rolle bei der richtigen Positionierung von Pyramidenneuronen im Hippocampus spielt, indem es die Expression von Oberflächenzelladhäsionsmolekülen reguliert und an der entsprechenden Bildung des räumlichen Gedächtnisses beteiligt ist.

Um die physiologische Funktion von RAB35 in der Säugetierentwicklung zu untersuchen, haben wir Rab35-Knockout-Mäuse mithilfe einer ES-Zelllinie erzeugt (ergänzende Abbildung 1a). Die Störung des Rab35-Gens wurde mittels Southern Blot und PCR validiert (ergänzende Abbildung 1b, c). Heterozygote Zielmäuse (Rab35geo/+ oder −/+) waren gesund und fruchtbar. Um die homozygoten Knockout-Mäuse (Rab35geo/geo und Rab35−/−) zu erhalten, kreuzten wir die heterozygoten Knockout-Mäuse und stellten fest, dass keine Nachkommen entweder Rab35geo/geo oder Rab35−/− waren, was darauf hinweist, dass Rab35-Nullmäuse embryonal letal sind. Am Embryonaltag (E) 15,5 und E11,5 wurden keine Rab35-Nullembryonen erhalten. Bei E9,5 waren 9 (32 %) Embryonen Rab35 +/+; 13 (46 %) Embryonen waren Rab35–/+; und 6 (21%) Embryonen waren Rab35 −/− (ergänzende Abbildung 1d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rab35 für die frühe Mausentwicklung essentiell ist.

Frühere Studien an Drosophila und neuronalen Zelllinien haben gezeigt, dass RAB35 eine wichtige Rolle bei verschiedenen neuronalen Funktionen spielt, einschließlich der Neurotransmitterfreisetzung, Neuritenverlängerung, Oligodendrozytendifferenzierung und Exosomensekretion9,11,15,20. Wir konzentrierten uns daher auf die In-vivo-Funktion von RAB35 bei der Gehirnentwicklung. Zu diesem Zweck haben wir zunächst die Expressionsprofile von RAB35 im Gehirn von Mäusen bestimmt. Der RAB35-Proteinspiegel stieg ab E15 allmählich an und erreichte am 14. postnatalen Tag (P) im sich entwickelnden Gehirn seinen Höhepunkt (Abb. 1a, b). Betrachtet man das gesamte Gehirn, wurde das RAB35-Protein bei E15.5 im Hippocampus exprimiert, wobei die Expression während der Entwicklung allmählich zunahm (Abb. 1c, d). Die LacZ-Färbung zeigte die RAB35-Expression in mehreren Unterregionen des Gehirns, einschließlich der Großhirnrinde, des Hippocampus und des Thalamus bei E15.5 (Abb. 1e). Im P1-Gehirn war die Expression im Hippocampus und in einem weiten Bereich der Großhirnrinde stärker ausgeprägt. Darüber hinaus wurde die RAB35-Expression im Riechkolben und im Kleinhirn der Gehirne erwachsener Mäuse identifiziert (Abb. 1f, g). Darüber hinaus untersuchten wir die Zelltypen, die RAB35 im Gehirn erwachsener Mäuse exprimieren, durch Immunfärbung auf β-Galactosidase unter Verwendung des reifen neuronalen Markers NeuN oder des Astrozytenmarkers Glia Fibrillary Acidic Protein (GFAP). Projektionsbilder mit maximaler Intensität zeigten β-Galactosidase-Punkte in NeuN-positiven und GFAP-positiven Zellen, was darauf hindeutet, dass RAB35 in Neuronen und Astrozyten exprimiert wird (Abb. 1h, i).

a RAB35-Proteinspiegel im gesamten Mausgehirn während der embryonalen (E15.5 und E17.5) und postnatalen (P2, P6, P14 und P21) Periode. b Quantifizierung der RAB35-Proteinspiegel im gesamten Mausgehirn. Die Bandenintensitäten von RAB35 wurden gegenüber denen von Aktin normalisiert (n = 3 pro angegebener Stufe). c RAB35-Proteinspiegel im Hippocampus während der embryonalen (E15.5 und E17.5) und postnatalen (P2, P6, P14 und P21) Periode. d Quantifizierung der RAB35-Proteinspiegel im Hippocampus der Maus (n = 3 pro Stadium). e X-Gal-Färbung sagittaler Schnitte von E15- und P1-Rab35geo/+-Mausgehirnen. Maßstabsbalken, 200 μm. f RAB35-Proteinspiegel in Gehirnunterregionen von 3 Monate alten Mäusen. Ob-Riechkolben, Cx-Großhirnrinde, Hp-Hippocampus, Th-Thalamus, Cb-Kleinhirn. g X-Gal-Färbung eines Sagittalschnitts eines 3 Monate alten Rab35geo/+-Mausgehirns. Maßstabsbalken, 500 μm. h, i Repräsentative Projektionsbilder mit maximaler Intensität des Gehirns einer 4 Monate alten Rab35geo/+-Maus, gefärbt auf β-Galactosidase (grün), NeuN oder GFAP (magenta) und DAPI (blau). Maßstabsleiste; obere Platte, 50 μm; untere Platte, 20 μm. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar.

Um die physiologische Bedeutung von RAB35 für die neuronale Entwicklung zu untersuchen, erzeugten wir ZNS-spezifische Rab35-Knockout-Mäuse, indem wir Mäuse, die das Rab35flox-Allel trugen, mit transgenen Mäusen kreuzten, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Nestin-Promotors (Nestin-Cre) exprimierten (Ergänzende Abb. 1a). Obwohl die Expression des RAB35-Proteins im Gehirn der Maus bei E13.5 nachweisbar war (Abb. 2a), war sie im gesamten Gehirn von E13.5 Rab35flox/flox nicht nachweisbar; Nestin-Cre-Embryonen und in der Großhirnrinde und im Hippocampus des 4 Monate alten Rab35flox/flox; Nestin-Cre-Mäuse (Abb. 2a, b). ZNS-spezifische Rab35-Mäuse mit bedingtem Knockout (cKO) wurden mit der Mendelschen Frequenz geboren und waren mehr als ein Jahr lang lebensfähig. Männliche und weibliche Rab35-cKO-Mäuse zeigten allmählich ein geringeres Körpergewicht als die Kontroll-Rab35flox/+; Nestin-Cre-Mäuse. (Ergänzende Abb. 1e, f).

a, b Western-Blot-Analyse von E13.5 (a) und 4 Monate alten (b) Rab35flox/flox, Rab35flox/+; Nestin-Cre und Rab35flox/flox; Gehirnlysate von Nestin-Cre-Mäusen. c–f Freilandtest in Kontrollmäusen (n = 13) und Rab35 cKO-Mäusen (n = 17). c Typische Spuren der horizontalen Bewegungsaktivität. d Zurückgelegte Strecke pro Minute. Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen; Interaktionseffekt, F(14, 392) = 1,094, p = 0,3612. e Zurückgelegte Gesamtstrecke. Mann-Whitney-Test, p = 0,3. f Aufenthaltsdauer im Mittelbereich. Mann-Whitney-U-Test, p < 0,001. g–j Erhöhtes Plus-Labyrinth bei Kontrollmäusen (n = 20) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 22). g Kumulierter Prozentsatz der Mäuse, die aus offenen Armen fallen. h Typische Spuren im Elevated-Plus-Labyrinth-Test. Ich bleibe Zeit in offenen Armen. Ungepaarter Student-T-Test, p = 0,0054. j Bleiben Sie Zeit in den geschlossenen Armen. Mann-Whitney-U-Test, p = 0,0034. k Rotarod-Test bei Kontrollmäusen (n = 23) und Rab35 cKO-Mäusen (n = 20). Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Korrektur; Interaktionseffekt, F(5, 205) = 3,009, p = 0,0121; Versuch 3, p = 0,0076; Versuch 4, p < 0,0001; Versuch 5, p = 0,0059; Versuch 6, p = 0,0008. l, m Barnes-Labyrinthtests bei Kontrollmäusen (n = 16) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 19). l Latenz bis zum Erreichen des Ziellochs. Jeder Punkt stellt den Mittelwert aus drei Versuchen dar. Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Korrektur; Interaktionseffekt, F(3, 99) = 1,706, p = 0,1706; Tag 1, p = 0,0261; Tag 4, p = 0,0030. m Zeit, die während eines Zeitraums von 90 Sekunden rund um das Zielloch verbracht wird. Mann-Whitney-U-Test, p = 0,0136. n Wechselprozentsätze im Y-Labyrinthtest von Kontrollmäusen (n = 15) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 18). T-Test des ungepaarten Studenten, p = 0,01454. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM oder Box- und Whisker-Diagramme dar; Boxplot zeigt 25. und 75. Perzentil (Box), Median (horizontaler Balken) und Minimum bis Maximum (Whisker); ns nicht signifikant (p > 0,05); *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; und ****p < 0,0001.

Um die Auswirkungen eines RAB35-Mangels auf das Verhalten von Mäusen zu bewerten, führten wir Verhaltenstests durch. Im Freilandtest, der die spontane motorische Aktivität und das angstbezogene Verhalten in einer neuartigen Umgebung misst, zeigten Rab35-cKO-Mäuse spontane Bewegungen mit ähnlichen Laufzeiten wie die Kontrollmäuse (Abb. 2c – e), was darauf hindeutet, dass ihre horizontalen Bewegungsaktivitäten waren vergleichbar. Unterdessen nahm die in der Mitte des Freilandapparats verbrachte Zeit bei Rab35-cKO-Mäusen signifikant zu (Abb. 2c, f). Anschließend führten wir den Elevated-Plus-Labyrinth-Test durch, um angstbedingte Verhaltensweisen zu beurteilen. Obwohl 13 der 22 Rab35-cKO-Mäuse während des Tests von den offenen Armen fielen (Abb. 2g), haben wir das Angstniveau von neun Mäusen bewertet, die den Test ohne Sturz abgeschlossen haben. Rab35-cKO-Mäuse verbrachten deutlich mehr Zeit in den offenen Armen und weniger Zeit in den geschlossenen Armen als Kontrollmäuse (Abb. 2h – j). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rab35-cKO-Mäuse ein verringertes angstbezogenes Verhalten zeigen.

Im beschleunigten Rotarod-Test, der zur Beurteilung der motorischen Funktion verwendet wird, erhöhten Kontrollmäuse nach mehreren Versuchen die Zeit, die sie auf dem rotierenden Stab verbrachten, wobei die meisten Kontrollmäuse schließlich mehr als 150 Sekunden auf einem Stab verbrachten. Im Gegensatz dazu zeigten Rab35-cKO-Mäuse eine deutlich verringerte Sturzlatenz (Abb. 2k). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein RAB35-Mangel die horizontale Bewegungsaktivität nicht beeinträchtigt, sondern zu Störungen im angstbedingten Verhalten und in der motorischen Funktion führt.

Darüber hinaus haben wir das räumliche Lernen und das Gedächtnis mithilfe des Barnes-Labyrinthtests bewertet (Abb. 2l, m). Das Barnes-Labyrinth besteht aus einem runden Tisch mit 16 Löchern am Umfang und visuellen Hinweisen rund um den Tisch. Von den 16 Löchern enthält nur eines eine Fluchtbox darunter, die als Ziel gilt. Dieser Test besteht aus mehreren Phasen, einschließlich der Erfassungsphase und dem Sondentest. Während der Erfassungsphase wurde die räumliche Lernfähigkeit jeder Maus bewertet, indem die Zeit gemessen wurde, die zum Erreichen des Ziels erforderlich war. Wie erwartet lernten die Kontrollmäuse die Position des Ziellochs, um helles Raumlicht zu vermeiden, und verkürzten so bei jedem Versuch die Zeit, die zum Erreichen des Ziels benötigt wurde. Rab35-cKO-Mäuse verbrachten am vierten Tag deutlich mehr Zeit damit, das Ziel zu erreichen als Kontrollmäuse (Abb. 2l). Der Sondentest wurde einen Tag nach dem letzten Erfassungsversuch durchgeführt, um die Erfassung des räumlichen Gedächtnisses zu untersuchen. Wir entfernten die Fluchtbox vom Tisch und maßen die Zeit, die sie in der Nähe des Ziels verbrachten, um festzustellen, ob sich die Mäuse die Position des Ziellochs eingeprägt hatten. Wie in Abb. 2m gezeigt, verbrachten Rab35-cKO-Mäuse etwas, aber deutlich weniger Zeit um das richtige Zielloch herum als Kontrollmäuse. Um die möglichen Auswirkungen von RAB35 auf das Kurzzeitgedächtnis zu analysieren, wurden Mäuse in einem Y-Labyrinth-Test untersucht. Der Prozentsatz des spontanen Wechsels bei Rab35-cKO-Mäusen war vergleichbar mit dem bei Kontrollmäusen (Abb. 2n). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Rab35-cKO-Mäuse Defizite im räumlichen Gedächtnis, jedoch nicht im Arbeitsgedächtnis aufweisen.

Als nächstes untersuchten wir, ob der Verlust von RAB35 die Gehirnarchitektur beeinflusst. Die Großhirnrinde von Säugetieren ist sechsschichtig aufgebaut. Während der kortikalen Entwicklung werden erregende Neuronen aus radialen Gliazellen auf der ventrikulären Seite erzeugt34,35. Neugeborene Neuronen wandern radial von der apikalen ventrikulären Seite zur basalen Pialoberfläche und hören direkt unterhalb der Randzone auf zu wandern. Daher bilden frühgeborene Neuronen die tiefe Schicht (Schichten VI und V), während spätgeborene Neuronen die tiefe Schicht passieren und sich in oberflächlicheren Schichten (Schichten IV–II) niederlassen. Daher wird die richtige sechsschichtige Struktur der Großhirnrinde geburtsdatumsabhängig von innen nach außen gebildet36,37. Kortikale Neuronen werden in Zellschichten aufgeteilt, wobei die Neuronen etwa im gleichen Zeitraum gebildet werden und schichtspezifische Transkriptionsfaktoren exprimieren, einschließlich Hühner-Ovalbumin-Upstream-Promotor-Transkriptionsfaktor-interagierender Proteine ​​2 (Ctip2; ein Marker für Schicht V) und geschnittener Homöobox 1 (Cux1; a Marker für Schicht II–IV), um schichtabhängige neuronale Verbindungen zu differenzieren und herzustellen.

Die Rückenansicht oder das Gehirngewicht von Rab35-cKO-Mäusen war mit denen von Kontrollmäusen vergleichbar (Abb. 3a, b). Bei Rab35-cKO-Mäusen waren die Dicke der Großhirnrinde und die relative Dicke der Cux1-positiven Oberflächenschicht (Schichten II–IV) sowie der Ctip2-positiven Tiefenschicht (Schicht V) mit denen von vergleichbar Kontrollmäuse bei P0, dem Zeitraum, in dem die meisten kortikalen erregenden Neuronen ihre Schicht erreichen (Abb. 3c – f). Wir haben die neuronale Migration in der Großhirnrinde mithilfe der 5-Ethinyl-2-desoxyuridin (EdU)-Markierungs-Geburtsdatumsanalyse weiter untersucht (Abb. 3g, h). EdU wurde trächtigen Mäusen bei E14,5 intraperitoneal injiziert, und die Gehirne der Welpen wurden bei P12 gesammelt. Die Großhirnrinde wurde von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche in 10 gleiche Bereiche unterteilt und der Anteil EdU-positiver Zellen in jedem Bereich quantifiziert. Mit EdU markierte RAB35-defiziente kortikale Neuronen zeigten keine signifikanten Migrationsdefekte. Die Immunfärbung auf NeuN ergab keinen signifikanten Unterschied in der Verteilung von NeuN-positiven Zellen zwischen den Kortizes von Kontrollmäusen und erwachsenen Rab35-cKO-Mäusen (Abb. 3i). Es wurde auch gezeigt, dass die Dicke der Großhirnrinde und die Anzahl der NeuN-positiven Zellen in den 300 μm breiten Kortexen bei Rab35-cKO-Mäusen erhalten bleiben (Abb. 3j, k). Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die laminierte Architektur in der Großhirnrinde von Mäusen mit RAB35-Mangel erhalten bleibt.

a Rückenansicht der Gehirne von 3 Monate alten Kontrollmäusen und Rab35-cKO-Mäusen. Maßstabsleiste, 2 mm. b Gehirngewichte von 3 Monate alten Kontrollmäusen (n = 7) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 8). Mann-Whitney-U-Test, p = 0,8409. c Repräsentative Bilder von P0-Kortizes der Kontroll- und Rab35-cKO-Mäuse, immungefärbt für Cux1 (Magenta), Ctip2 (grün) und DAPI (blau). Maßstabsbalken, 100 μm. d–f Quantifizierung der kortikalen (d), relativen Cux1-positiven (e) und Ctip2-positiven (f) Schichtdicke von P0-Kontrollmäusen (n = 4) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 4). Die Dicken der Cux1-positiven und Ctip2-positiven Schichten wurden gemessen und gegen die gesamte kortikale Dicke normalisiert. Mann-Whitney-U-Test; d, p = 0,6857; e, p > 0,99; f, p = 0,2. g Repräsentative EdU-Kennzeichnung von Geburtsdatumsanalysebildern von P12-Cortex-Proben, gefärbt mit EdU (magenta) und DAPI (blau). Maßstabsbalken, 100 μm. h Anteil EdU-positiver Neuronen in P12-Kortizes von Kontrollmäusen (n = 4) und Rab35 cKO-Mäusen (n = 4). Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Korrektur; Interaktionseffekt, F(9, 54) = 0,4991, p = 0,8687. i Immunhistochemie sagittaler Abschnitte der Großhirnrinde von 4 Monate alten Kontroll- und Rab35-cKO-Mäusen unter Verwendung eines Anti-NeuN-Antikörpers. Maßstabsbalken, 100 μm. j, k Quantitative Analyse der kortikalen Dicke (j) und der Anzahl NeuN-positiver Zellen in der 300 μm breiten Großhirnrinde (k) der Kontrollmäuse (n = 5) und Rab35-cKO-Mäuse (n = 5). T-Test des ungepaarten Studenten; j, p = 0,6928; k, p = 0,5375. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM oder Box- und Whisker-Diagramme dar; Boxplot zeigt 25. und 75. Perzentil (Box), Median (horizontaler Balken) und Minimum bis Maximum (Whisker); ns, nicht signifikant (p > 0,05).

Im Gegensatz zur Großhirnrinde stellten wir fest, dass die laminierte Struktur des Hippocampus bei Rab35-cKO-Mäusen stark desorganisiert war (Abb. 4a). Der Hippocampus enthält eine dicht gepackte Pyramidenzellschicht, auch Stratum Pyramidale (SP) genannt, des Ammonshorns (CA1-, CA2- und CA3-Regionen) und eine Körnerzellschicht (GCL) des Gyrus dentatus (DG), wie in der Abbildung gezeigt Kontrollmäuse. Im Rab35-cKO-Hippocampus war der SP in CA1 jedoch deutlich in Stratum Oriens (SO) gebrochen, und die Pyramidenzellen in CA3 waren weiter verbreitet. Ektopische Pyramidenneuronen wurden in der ventralen CA1-Region des Hippocampus beobachtet (ergänzende Abbildung 2a). Basierend auf der quantitativen Bin-Analyse zeigten Rab35-cKO-Mäuse signifikante Veränderungen in der Pyramidenzellverteilung in CA1 und CA3 (Abb. 4b, c). Die Anzahl der NeuN-positiven Neuronen in den RAB35-defizienten CA1- oder CA3-Regionen war mit denen in den Kontrollen vergleichbar (ergänzende Abbildung 2b, c). Darüber hinaus verteilten sich die Körnerzellen im DG mit einer erhöhten Zellzahl in Rab35-cKO-Mäusen in Richtung der Molekülschicht (Abb. 4d und ergänzende Abb. 2d). Die für Ctip2 positiven CA1-Neuronen, die hier als postmitotischer neuronaler Marker verwendet werden, zeigten eine geteilte Zellschicht bei P6, dem Zeitraum, in dem die meisten neugeborenen erregenden Hippocampus-Neuronen ihre endgültige Position erreichen (ergänzende Abbildung 2e), was darauf hindeutet, dass sich Hippocampus-Neuronen ektopisch positionieren während der Entwicklungsphase.

a Immunhistochemie sagittaler Schnitte von Hippocampi von 4 Monate alten Kontroll- und Rab35-cKO-Mäusen unter Verwendung eines Anti-NeuN-Antikörpers. SP: Stratum Pyramidale, SO: Stratum Orients. Maßstabsbalken, 200 μm. b–d Verteilung von NeuN-positiven Zellen in den Hippocampus-CA1- (b), CA3- (c) und DG-(d)-Regionen der Kontrollmäuse (n = 4) und Rab35-cKO-Mäuse (n = 4). Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Korrektur; b Interaktionseffekt, F(4, 32) = 4,161, p = 0,008; c Interaktionseffekt, F(4, 32) = 3,264, p = 0,0236; d Interaktionseffekt, F(4, 32) = 25,9, p < 0,0001. e Repräsentative Bilder von P12-Hippocampi, gefärbt mit EdU (Magenta) und DAPI (Blau). Maßstabsbalken, 100 μm. f Anteil der EdU-positiven Neuronen im P12-Hippocampi von Kontrollmäusen (n = 4) und Rab35-cKO-Mäusen (n = 4). Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Korrektur; Interaktionseffekt, F(4, 24) = 3,712, p = 0,0173. g Repräsentative Bilder von DIV 3-Hippocampus-Primärneuronen, gefärbt auf p-NF (grün) mit Rhodamin-Phalloidin (Magenta) und DAPI (blau). Maßstabsbalken, 100 μm. h, i Quantifizierung der Rhodamin-Phalloidin-positiven Gesamtneuritenlänge (h) und der p-NF-positiven Axonlänge (i) der Kontroll- und Rab35-defizienten Primärneuronen bei DIV 3. Mindestens 50 Neuronen von vier (Kontrolle) und drei (Rab35 cKO) verschiedene Kulturen wurden gemessen. T-Test des ungepaarten Studenten; h, p = 0,8204; ich, p = 0,8832. j Repräsentative Bilder der ventralen Hippocampus-Kommission (VHC) von 3 Monate alten Kontroll- und Rab35-cKO-Mäusen (Bregma −0,35 mm) durch Klüver-Barrera-Färbung. Maßstabsbalken, 200 μm. k VHC-Dicke in Kontrollmäusen (n = 6) und Rab35 cKO-Mäusen (n = 7). Ungepaarter Student-T-Test, p = 0,0695. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar; ns nicht signifikant (p > 0,05); *p < 0,05; **p < 0,01; und ***p < 0,001.

Da die Pyramidenneuronen des Hippocampus von Nagetieren in den CA1–CA3-Regionen aus einem Neuroepithel erzeugt werden, das dorsal mit dem Neocortex geteilt wird, wird angenommen, dass die laminierten Strukturen in den CA-Regionen des Hippocampus ähnliche Muster wie diejenigen in der Großhirnrinde bilden27,38. Während der Entwicklung der Großhirnrinde und des Hippocampus werden erregende Neuronen aus zwei Haupttypen von Vorläuferzellen erzeugt: radialen Gliazellen in der ventrikulären Zone (VZ) und intermediären Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone (SVZ)34,35. Radiale Gliazellen produzieren im VZ durch asymmetrische Teilung intermediäre Vorläufer oder Neuronen, während intermediäre Vorläufer wandern und sich in der subventrikulären Zone (SVZ) knapp über dem VZ ansammeln. Die Bildung der laminierten Strukturen im Hippocampus hängt in erster Linie von der hochkoordinierten Produktion und Migration von Neuronen aus den proliferativen Zonen ab. Die räumlich-zeitliche Kontrolle der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen ist wichtig für die Produktion und Positionierung von Neuronen. Neben dem Proliferationspotenzial spielt auch die Morphologie radialer Gliazellen eine wichtige Rolle bei neuronalen Positionen, da neugeborene Neuronen radiale Fortsätze als Gerüste nutzen, um in primitivem SP zur endgültigen Position zu wandern.

Anschließend untersuchten wir die funktionelle und morphologische Integrität der neuronalen Vorläufer im Rab35-cKO-Hippocampus. Die Verteilungen der gepaarten Box-Protein 6 (Pax6)-positiven radialen Gliazellen und T-Box-Gehirnprotein 2 (Tbr2)-positiven Zwischenvorläufer waren in den Kontroll- und Rab35-cKO-CA-Regionen bei E15.5 ähnlich (ergänzende Abbildung 2f, G). Die Anzahl beider Vorläufer war bei Kontroll- und Rab35-cKO-Mäusen vergleichbar (ergänzende Abbildung 2h, i). Die Immunfärbung auf phosphoryliertes Histon H3 (pHH3), einen Marker für Zellen, die sich einer Mitose unterziehen, zeigte, dass sich die Anzahl der pHH3-positiven Zellen in der Rab35-cKO-CA-Region im Vergleich zu den Kontrollmäusen nicht signifikant veränderte (ergänzende Abbildung 2j, k). Ähnliche Ergebnisse wurden in DG erzielt (ergänzende Abbildung 2l – n). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die bedingte Deletion von Rab35 unter Verwendung transgener Nestin-Cre-Mäuse das räumliche Muster und die Proliferationsstärke neuronaler Vorläufer im Hippocampus nicht beeinflusst. Darüber hinaus führten wir eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen Nestin, einem Zwischenfilamentprotein in radialen Gliazellen, durch, um die Morphologie der radialen Fortsätze zu beobachten. Nestin-positive radiale Gliafortsätze schienen in den sagittalen Abschnitten des E15.5 Rab35 cKO-Hippocampus normal organisiert zu sein (ergänzende Abbildung 2o). Aus diesen Daten geht hervor, dass Funktion und Form der neuralen Vorläuferzellen des Hippocampus in Rab35-cKO-Mäusen erhalten bleiben.

Da der Verlust von RAB35 keine Auswirkungen auf neurale Vorläuferzellen hatte, untersuchten wir mithilfe der EdU-Geburtsdatumsanalyse, ob eine Fehlbildung der Hippocampusschicht auf eine fehlerhafte Migration oder Positionierung von Neuronen während der Entwicklung zurückzuführen ist (Abb. 4e, f). Die Hippocampus-CA1-Region vom Rand der apikalen Oberfläche bis 400 μm wurde in fünf gleiche Behälter unterteilt und der Anteil EdU-positiver Zellen in jedem Behälter quantifiziert. Bei Kontrollmäusen erreichten über 90 % der EdU-positiven Neuronen die Bins 2 und 3, wohingegen bei Rab35-cKO-Mäusen der Anteil der EdU-positiven Neuronen in den Bins 2 und 3 mit einem Anstieg in den Bins 1 und 4 abnahm (Abb. 4f). ), was darauf hindeutet, dass neuronale Zellen migrieren könnten, aber nicht an den genauen Ort verteilt würden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAB35 für die präzise Verteilung der Pyramidenzellen im sich entwickelnden Hippocampus erforderlich ist.

Basierend auf früheren Studien, dass der Abbau von RAB35 die Verlängerung von Neuriten in PC12-Zellen und Axonen in primären Hippocampusneuronen der Ratte unterdrückt und die Überexpression von Wildtyp- oder konstitutiv aktivem Mutanten-RAB35 die Verlängerung verstärkt, untersuchten wir die Neuritogenese in primären Neuronen, die aus Rab35-cKO-Mäusen gewonnen wurden . Primäre Neuronen des Hippocampus, die tagelang in vitro (DIV) 3 kultiviert wurden, wurden einer Immunfärbung auf einen Axonmarker, phosphorylierte Neurofilament-Schwerkette (pNF-H) und Rhodamin-Phalloidin, unterzogen (Abb. 4g). Die Längen sowohl des Phalloidin-positiven Gesamtneuriten als auch des pNF-H-positiven Axons in RAB35-defizienten primären Neuronen waren mit denen in Kontrollneuronen vergleichbar (Abb. 4h, i), was darauf hinweist, dass primäre Neuronen, die vom Rab35-cKO-Hippocampus abgeleitet sind, ausreichend erhalten bleiben Potenzial für Neuritogenese. Um die Rolle von RAB35 bei der Axonverlängerung in vivo zu bewerten, untersuchten wir die Dicke der ventralen Hippocampuskommissur (VHC) (Abb. 4j, k). Rab35-cKO-Mäuse zeigten im Vergleich zu Kontrollmäusen tendenziell eine relativ geringere VHC-Dicke; Dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Neuritogenese trotz des Fehlens von RAB35 nicht wesentlich beeinträchtigt ist.

Um einen Einblick in den molekularen Mechanismus zu erhalten, durch den RAB35 zur neuronalen Migration beiträgt, haben wir die unterschiedliche Proteinexpression im Hippocampus von P0 in Kontrollmäusen und Rab35-cKO-Mäusen mithilfe einer multiplexierten isobaren Tandem-Massen-Tag-Markierung (TMT) und einer LC-MS/MS-Analyse untersucht . Im Hippocampus P0 erreichte die Neurogenese ihren Höhepunkt und die meisten Pyramidenneuronen wanderten in Richtung ihrer Position. Von den 7495 Proteinen, die mithilfe der P0-Hippocampus-Proteomik identifiziert und quantifiziert wurden, wurden 193 signifikant hoch- oder herunterreguliert, wenn der Schwellenwert auf p <0, 01 eingestellt wurde (Abb. 5a und ergänzende Daten 1). In Übereinstimmung mit der Western-Blot-Analyse (Abb. 2a, b) bestätigten wir, dass das RAB35-Protein deutlich verringert war. Dieser Datensatz umfasste 37 Proteine, die mit dem Membranverkehr zusammenhängen, insbesondere die Recycling- und Endozytosewege, und 35 von 37 Proteinen, einschließlich RAB11B, RAB4A, Snx3, Atg9a, Vamp4 und RAB7, waren im Rab35-cKO-Hippocampus verringert (Abb. 5b und Ergänzungstabelle). 1), was darauf hindeutet, dass der Verlust von RAB35 die Recycling- und Endozytosewege stören könnte.

ein Vulkandiagramm der TMT-basierten quantitativen Proteome zur Identifizierung der fehlregulierten Proteine ​​im Rab35-cKO-Hippocampus im Vergleich zum Kontrollhippocampus (n = 5 Mäuse pro Genotyp). b Anzahl der Proteine, die als signifikant fehlreguliert identifiziert wurden und entweder mit dem Membranverkehr oder mit der neuronalen Migration zusammenhängen. c, d Western-Blot-Analyse von Kontroll- und Rab35-cKO-P0-Hippocampi unter Verwendung von Anti-Contactin-2-, Anti-CHL1- und Anti-Actin-Antikörpern. e, f Quantifizierung der Contactin-2- (c) und CHL1- (d) Proteinspiegel in Kontroll- und Rab35-cKO-P0-Hippocampi. Die Bandenintensitäten der angegebenen Proteine ​​wurden auf die von Aktin normalisiert (n = 9 Mäuse pro Genotyp). T-Test des ungepaarten Studenten; e, p = 0,0153; f, p = 0,0095. g, h Die Konzentrationen von Contactin-2 (g) und CHL1 (h) wurden durch gezielte MS unter Verwendung der PRM-Methode quantifiziert (n = 5 Mäuse pro Genotyp). T-Test des ungepaarten Studenten; gp = 0,0053; PS = 0,0229. i Western-Blot-Analyse des Kontroll- und Rab35-cKO-P0-Hippocampus unter Verwendung von Anti-N-Cadherin- und Anti-Actin-Antikörpern. j Quantifizierung der N-Cadherin-Proteinspiegel im Kontroll- und Rab35-cKO-P0-Hippocampus (n = 9 Mäuse pro Genotyp). Ungepaarter Student-T-Test, p = 0,9020. k Repräsentative Bilder von DIV 2 primären Hippocampusneuronen, gefärbt auf Contactin-2 (grün), Rhodamin-Phalloidin (magenta) und DAPI (blau). Maßstabsbalken, 20 μm. l Quantifizierung der Contactin-2-Intensität an der somatischen Plasmamembran in Kontrollzellen (n = 4) und Rab35-defizienten Zellen (n = 4). Pro Genotyp wurden 30 Neuronen aus vier verschiedenen Kulturen analysiert. Mann-Whitney-U-Test, p = 0,0286. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar; ns nicht signifikant (p > 0,05); *p < 0,05; **p < 0,01.

Im Datensatz fanden wir heraus, dass 25 neuronale Migrationsproteine ​​vom Verlust von RAB35 betroffen sind. Unter diesen war Contactin-2/transient exprimiertes axonales Oberflächenglykoprotein-1 (TAG-1) und das enge Homolog von L1 (CHL1) im Rab35-cKO-Hippocampus signifikant häufiger anzutreffen als in Kontrollmäusen (Abb. 5a und Ergänzungstabelle 2). . Contactin-2 und CHL1 sind neurale Zelladhäsionsmoleküle (NCAMs) der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF), die zur Contactin- bzw. L1-Unterfamilie gehören. Contactin-2 und CHL1 sind auf der Zelloberfläche vorhanden und vermitteln Zell-Zell- und Zell-Substrat-Adhäsionen über homophile und/oder heterophile Wechselwirkungen mit anderen Zelladhäsionsmolekülen und der extrazellulären Matrix, um eine Rolle beim Axonwachstum und bei der Führung wandernder Neuronen zu spielen im sich entwickelnden Gehirn. Mithilfe der Western-Blot-Analyse und der gezielten Massenspektrometrie auf der Basis paralleler Reaktionsüberwachung (PRM) haben wir bestätigt, dass die Proteinspiegel von Contactin-2 und CHL1 im P0 Rab35-cKO-Hippocampus signifikant erhöht waren (Abb. 5c – h). Die Proteingehalte anderer Zelladhäsionsmoleküle, einschließlich N-Cadherin der Cadherin-Familie, blieben bei Kontroll- und Rab35-KO-Mäusen unverändert (Abb. 5i, j). In DIV 2-Hippocampus-Neuronen, die aus E18-Embryonen isoliert wurden, wurde gezeigt, dass Contactin-2 an der Plasmamembran des Soma und der Neuriten lokalisiert ist (Abb. 5k). Darüber hinaus war die Fluoreszenzintensität von Contactin-2 an der somatischen Plasmamembran von RAB35-defizienten Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen signifikant höher (Abb. 5l). Exogen exprimiertes GFP-RAB35 neigte dazu, den Pegel des Contactin-2-Signals auf der somatischen Plasmamembran im Vergleich zu dem in Kontrollzellen zu verringern; Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant (ergänzende Abbildung 2p). Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die RAB35-Ablation die Proteinhomöostase im sich entwickelnden Hippocampus beeinflusst, was zu erhöhten Contactin-2- und CHL1-Spiegeln führt, was höchstwahrscheinlich auf einen Defekt bei der Internalisierung von der Zelloberfläche und/oder dem Recycling zurück zur Plasmamembran zurückzuführen ist.

RAB35 spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen, die mit dynamischen Membranveränderungen verbunden sind, wie z. B. endozytischem Recycling, Zytokinese, Zellmigration und Neuritenwachstum. Die physiologische Funktion von Säugetier-RAB35 muss jedoch noch untersucht werden. Diese Studie, an der systemische und ZNS-spezifische Rab35-Knockout-Mäuse beteiligt waren, identifizierte RAB35 als eine wesentliche Komponente bei der Entwicklung des Hippocampus, indem es die neuronale Positionierung richtig reguliert.

Systemischer Rab35-Knockout verursachte embryonale Letalität bis E11.5, was darauf hindeutet, dass RAB35 für die Embryonalentwicklung essentiell ist. Homozygote Rab35-Knockout-Embryonen wurden bei E9,5 mit der erwarteten Mendelschen Häufigkeit erhalten (ergänzende Abbildung 1), was darauf hindeutet, dass Rab35-Knockout-Embryonen implantiert wurden, sich aber nicht entwickelten. Nach der Implantation bildet die Gastrulation wesentliche Schichten, einschließlich Ektoderm, Mesoderm und Endoderm. Viszerale Endodermzellen weisen eine hohe endozytische Aktivität auf, liefern mütterliche Nährstoffe und steuern Signalkaskaden für das Embryonalwachstum. Interessanterweise stört ein RAB7-Mangel den endozytischen Fluss in viszeralen Endodermzellen und führt zu verringerten Mengen an intrazellulären Aminosäuren sowie einer gestörten zellulären Signalübertragung, was zu einem tödlichen embryonalen Phänotyp bei E739,40 führt. Eine mögliche Erklärung für die wesentliche Natur von RAB35 während der Entwicklung ist, dass Rab35-Knockout-Embryonen Defekte in den Recyclingwegen im viszeralen Endoderm aufweisen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Rolle von RAB35 bei der Embryogenese von Mäusen festzustellen. Darüber hinaus haben wir auch ZNS-spezifische Rab35-cKO-Mäuse erzeugt, um die Rolle von RAB35 bei der Gehirnentwicklung zu untersuchen. ZNS-spezifische Rab35-cKO-Mäuse hatten vergleichbare Gehirngewichte wie Kontrollmäuse und bewahrten die laminierte Struktur der Großhirnrinde (Abb. 3). Obwohl RAB35 an der Neuritogenese beteiligt ist, zeigten Neuronen von Rab35-cKO-Mäusen in vitro und in vivo verlängerte Axone (Abb. 4). Diese Diskrepanz kann aufgrund von Unterschieden in den verwendeten Zelllinien/Geweben oder aufgrund von Unterschieden zwischen chronischer und akuter Erschöpfung von RAB35 entstehen. Alternativ können andere RAB-Proteine ​​die durch den Verlust von RAB35 während der frühen Gehirnentwicklung verursachten Defekte kompensieren.

Im Gegensatz dazu zeigten RAB35-defiziente Hippocampi eine desorganisierte Zellschicht in den CA- und DG-Regionen (Abb. 4). Die Bildung der Hippocampus-Lamination erfolgt unter strenger räumlich-zeitlicher Kontrolle der neuronalen Produktion und der Migration von Neuronen aus den proliferativen Zonen. Das Proliferationspotential und die Morphologie der radialen Gliazellen waren bei Rab35-cKO-Mäusen normal (ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass weder eine fehlerhafte neuronale Proliferation aus radialen Gliazellen noch radiale Prozesse, die als Gerüst für wandernde Neuronen dienen, die Hauptursachen für die Fehlpositionierung mutierter Neuronen sind. In der Geburtsdatumsanalyse migrierten Rab35-cKO-Neuronen, konnten jedoch nicht an bestimmte Orte wandern. Diese Daten deuten darauf hin, dass RAB35 für die präzise Verteilung von Pyramidenzellen im sich entwickelnden Hippocampus erforderlich ist.

Obwohl berichtet wurde, dass mehrere mit Endozytose assoziierte RAB-Proteine ​​(RAB5, 7, 11, 18, 23) eine wichtige Rolle bei der Bildung der sechsschichtigen Struktur in der Großhirnrinde spielen, indem sie bestimmte Schritte der neuronalen Migration regulieren30,31,32, Die Beteiligung dieser RAB-Proteine ​​an der Hippocampus-Laminierung ist weiterhin unbekannt. Interessanterweise zeigten RAB35-defiziente Mäuse eine oberflächlich normale Großhirnrindenstruktur, zeigten jedoch eine fehlerhafte Hippocampus-Laminierung, was darauf hindeutet, dass RAB35 überwiegend zur korrekten neuronalen Positionierung im Hippocampus beiträgt als in der Großhirnrinde.

Wie stört der Verlust von RAB35 den Membrantransport in Hippocampus-Neuronen erheblich? Eine mögliche Erklärung ist, dass der Verlust von RAB35 die Homöostase von Phosphoinositid (PI) verändert und zu Störungen im Endozytosetransport führt. Es ist bekannt, dass RAB35 die PI-Homöostase, insbesondere PtdIns(4,5)P2 und PtdIns3P/PtdIns(3,5)P2, in Koordination mit seinen Effektoren ACAP2 bzw. Myotubularinphosphatasen reguliert. ACAP2 ist ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP) für Arf6, das seinen Effektor PIP5K zur Synthese von PtdIns(4,5)P2 aktiviert. Aktiviertes RAB35 lokalisiert sich in Arf6-positiven Kompartimenten und rekrutiert dann ACAP2, um Arf6 zu inaktivieren und die PtdIns(4,5)P2-Synthese zu beenden3,41,42. Im Gegensatz dazu haben neuere Studien berichtet, dass RAB35 den Umsatz von PtdIns3P und PtdIns(3,5)P2 steuert, indem es an Myotubularin-verwandte Protein-13- und MTMR2-haltige Lipidphosphatasekomplexe bindet, die das 3-Phosphat aus PtdIns3P und PtdIns( 3,5)P2 befindet sich auf Endosomen. Somit könnte das Fehlen von RAB35 einen lokalen Anstieg von PtdIns(4,5)P2, PtdIns3P und PtdIns(3,5)P2 hervorrufen und dadurch die Recycling- und Endozytosewege stören. Tatsächlich zeigten die Ergebnisse der Proteomikanalyse, dass die Konzentrationen verschiedener endozytischer Regulatoren wie Snx3 und Snx27, die beide an PtdIns3P und PIP5k1c binden, in RAB35-defizienten Hippocampuslysaten signifikant reduziert waren (Abb. 5 und Ergänzungstabelle 1). .

Wir fanden auch heraus, dass IgSF-Zelloberflächenproteine, nämlich Contactin-2 und CHL1, im sich entwickelnden Rab35-cKO-Hippocampus zunahmen. Es wurde berichtet, dass CHL1 eine Rolle bei der neuronalen Migration im Kleinhirn und in der kaudalen Großhirnrinde spielt43,44,45. Während der Entwicklung des Kleinhirns steuert das Protein CHL1 der L1-Familie die neuronale Migration über heterophile Trans-Wechselwirkungen von CHL1 mit Vitronektin und Integrinen. Darüber hinaus interagierten die zytoplasmatischen Regionen von CHL1 mit Ezrin und Ankyrin, um an der Aktindynamik teilzunehmen46,47. Der Anstieg oder Abfall des Spiegels eines anderen Proteins der L1-Familie verzögerte die Migration kortikaler Neuronen48,49. Es wurde auch berichtet, dass Contactin-2 an der Migration von kortikalen Interneuronen und kaudalen Markneuronen beteiligt ist50,51. Contactin-2 band über eine cis-Interaktion an L1 und ermöglichte es L1, Ankyrin52 zu rekrutieren. Da RAB35 für die Endozytose und das Recycling von Zelloberflächenproteinen erforderlich ist, könnte der Verlust von RAB35 das Recycling und die Ausrichtung dieser Moleküle an die geeigneten Orte für die neuronale Migration stören, was zu einer ungeordneten Verteilung von Pyramidenneuronen und Körnerzellen im Hippocampus führen würde . Darüber hinaus kann ein RAB35-Mangel die intrazelluläre Aktindynamik beeinträchtigen. Alternativ kann der Verlust von RAB35 zu einer abnormalen lokalen Akkumulation von PI-Derivaten auf den Membrankompartimenten führen und dadurch den endozytischen Transport von Zelloberflächenproteinen stören.

Verhaltenstests ergaben, dass ZNS-spezifische Rab35-cKO-Mäuse Defekte in einem breiten Spektrum von Verhaltensweisen aufweisen, wie z. B. angstbezogenem Verhalten und motorischer Funktion sowie im räumlichen Gedächtnis. (Abb. 2). Der dorsale Hippocampus ist für räumliches Lernen und Gedächtnis verantwortlich, während der ventrale Hippocampus als Teil des Angstschaltkreises fungiert. Daher könnte eine verminderte räumliche Gedächtnisleistung bei Rab35-cKO-Mäusen mit einer unorganisierten Hippocampus-Laminierung verbunden sein. Mehrere Gehirnregionen, darunter die Amygdala, das Striatum, der ventrale Hippocampus und der präfrontale Kortex, modulieren angstbezogenes Verhalten. Unsere Daten legen nahe, dass eine gestörte Schichtbildung im ventralen Hippocampus von Rab35-cKO-Mäusen angstähnliche Verhaltensweisen beeinflussen kann. Da RAB35 auch in anderen Gehirnregionen exprimiert wird, einschließlich des Striatums und des präfrontalen Kortex, kann der Verlust von RAB35 in diesen Regionen zu einem verringerten angstbedingten Verhalten bei Rab35-cKO-Mäusen beitragen. Daher sind weitere Studien erforderlich, um die physiologische Rolle von RAB35 bei der Entwicklung und Funktion des Gehirns zu verstehen.

Aktuelle Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen RAB35 und neurodegenerativen Erkrankungen hin. Unsere Proteomikdaten zeigten einen signifikanten Rückgang der mit der Alzheimer-Krankheit verbundenen Faktoren LRP1 und Presenilin im RAB35-defizienten Hippocampus. Eine weitere Charakterisierung der physiologischen und pathologischen Funktionen von RAB35 wird zu einem besseren Verständnis der molekularen Pathologie neurodegenerativer Erkrankungen führen.

Rab35-Knockout-Mäuse wurden wie zuvor beschrieben erzeugt53. Rab35-Knockout-ES-Klone wurden von EUCOMM gekauft, wobei die SA-IRES-βgeo-polyA-Sequenz in das zweite Intron des Rab35-Gens eingefügt wurde. Die gezielten ES-Klone wurden mittels Southern-Blot-Analyse identifiziert und in die BALB/c-Embryonen injiziert, um die Rab35geo/+-Mäuse zu erzeugen. Die Mäuse wurden mehr als sechs Generationen lang auf den C57BL/6-Hintergrund zurückgekreuzt. Um die Rab35flox/+- und Rab35–/+-Mäuse zu erzeugen, wurden die Rab35geo/+-Mäuse mit transgenen Act-Flp-e- bzw. CAG-Cre-Mäusen (Jackson Laboratory) gekreuzt. Um die ZNS-spezifischen Rab35-Knockout-Mäuse zu erzeugen, wurden Rab35flox/+-Mäuse mit transgenen Nestin-Cre-Mäusen gekreuzt33. Die Genotypen jeder Mauslinie wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt: Primer 1 (5'-Arm), 5'-ACACTTCACATGGCTCTCTGGTCC-3'; Primer 2 (3′-Arm), 5′-CTCTAGCAGACCCACAATGCGAGC-3′; Primer 3 (LAR3), 5'-CAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC-3'; und Primer 4 (40 R), 5'-TGAACTGATGGCGAGCTCAGACC-3′. Das cre-Gen wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer identifiziert: vorwärts, 5'-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3'; und umgekehrt, 5′-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3′. Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Animal Care and Experimentation Committee der Universität Gunma, Japan (Genehmigungsnr. 19-001) genehmigt und durchgeführt. Mäuse wurden im Bioresource Center der Gunma University, Graduate School of Medicine, Japan, gezüchtet.

Die folgenden primären Antikörper wurden für das Immunblotting verwendet: 1:1000 RAB35 (Kaninchen; Cell Signaling, 9690 S), 1:10.000 Actin [C4] (Maus; Merck-Millipore, MAB1501), 1:10.000 GAPDH [6C5] (Maus; Merck-Millipore, MAB374), 1:1000 Contactin-2/TAG-1 (Ziege; F&E-Systeme, AF4439), 1:1000 CHL1 (Ziege; F&E-Systeme, AF2147) und 1:1000 N-Cadherin [32/N -Cadherin] (Kaninchen; BD, 610920). Die folgenden primären Antikörper wurden für die Immunfärbung verwendet: 1:100 NeuN [A60] (Maus; Merck-Millipore, MAB377), 1:200 GFAP (Kaninchen, Frontier Institute, GFAP-Rb-Af800), 1:200 β-Galactosidase ( Maus, Promega, Z3781), 1:100 Cux1 (Kaninchen; Santa Cruz, sc13024), 1:100 Ctip2 (Ratte; Abcam, ab18465), 1:300 phosphoryliertes Neurofilament [SMI-31] (Maus; Covance, SMI-31R ), 1:500 Tbr2 (Kaninchen; Abcam, ab23345), 1:300 Pax6 (Kaninchen; BioLegend, PRB-278P), 1:200 Phospho-Histone H3 (Ser10) [RR002] (Kaninchen; Cell Signaling, 9701), und 1:100 Nestin [Rat-401] (Maus; Invitrogen, 14-5843-82). Die folgenden sekundären Antikörper wurden für die Immunfärbung verwendet: Ziege-Anti-Ratte-Alexa-Fluor-488, Esel-Anti-Maus-Alexa-Fluor-488, Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-488, Esel-Anti-Maus-Alexa-Fluor-594 und Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor-594 (alle Antikörper stammen von Life Technologies).

Frische Gehirne wurden mit 2 % Paraformaldehyd (PFA)/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 30 Minuten bis 2 Stunden bei 4 °C fixiert und nacheinander über Nacht bei 4 °C in eine Reihe von 5, 10 und 30 % Saccharose in PBS überführt C. Die Gehirne wurden in Tissue-Tek OCT-Compound (Sakura Finetek) eingebettet und in einer Dicke von 30 μm kryogeschnitten. Die Schnitte wurden auf Objektträger montiert und mit Lösung C (0,01 % Natriumdesoxycholat, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA und 2 mM MgCl2 in PBS) gewaschen und in Lösung D (0,5 mg/ml X-Gal, 10) inkubiert mM K3[Fe(CN)6] und 10 mM K4[Fe(CN)6] in Lösung C) über Nacht bei 37 °C. Nach 10-minütiger Fixierung mit 4 % PFA/PBS wurden die Schnitte einer kernechten Rotfärbung unterzogen. Die Bilder wurden mit einem BX50-Mikroskop (Olympus) aufgenommen.

Erwachsene Mäuse wurden mit 4 % PFA/PBS transkardial perfundiert und die Gehirne über Nacht bei 4 °C nachfixiert. Für Paraffinschnitte wurden die fixierten Gehirne in 70 % Ethanol dehydriert, in Paraffin eingebettet und mit einer Dicke von 4 μm geschnitten. Die Schnitte wurden einer Antigengewinnung unter Verwendung eines Autoklaven in 0,01 M Citratpuffer bei 105 °C für 15 Minuten unterzogen und mit 3 % H2O2/MeOH für 30 Minuten inkubiert. Nach 30-minütiger Blockierung mit 5 % BSA/PBS wurden die Schnitte mit Anti-NeuN [A60]-Antikörper in 1 % BSA/PBS bei 4 °C über Nacht inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit EnVision Plus System-HRP-markiertem Polymer-Anti-Maus Kit (DAKO Cytomation, K4000) für 1 Stunde. Das Signal wurde mit dem Liquid-DAB-Substrat-Chromogen-System (DAKO Cytomation) sichtbar gemacht. Nach dem Spülen mit Wasser wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Mikroskop (Keyence) oder einem BX50 (Olympus) aufgenommen. Zur Quantifizierung der kortikalen Dicke und der Anzahl NeuN-positiver Zellen wurden Bilder der 300 μm breiten Großhirnrinde mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health) analysiert. Für die Bin-Analyse des Hippocampus wurden Bilder mit 200 μm Breite × 500 μm Länge in CA1 und CA3 oder 200 μm Breite × 250 μm Länge in DG in fünf gleiche Bins unterteilt; Anschließend wurden die NeuN-positiven Zellzahlen in jedem Behälter mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health) gezählt. Für gefrorene Schnitte wurden die aus E15-Embryonen und P0- und P6-Jungtieren isolierten Gehirne über Nacht in 4 % PFA/PBS bei 4 °C fixiert, über Nacht in 30 % Saccharose/PBS bei 4 °C dehydriert und in Tissue-Tek OCT-Verbindung eingebettet. und kryogeschnitten. Die 10 μm dicken Schnitte wurden einer Antigengewinnung in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) bei 90 °C für 10 Minuten (für Cux1-, Ctip2-, Pax6- und Tbr2-Färbung) oder in Histo VT one (NACALAI TESQUE) bei 70 °C unterzogen °C 10 Min. (für pHH3-Färbung), gefolgt von Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X/PBS für 10 Min. (Pax6- und Tbr2-Färbung). Nach 10-minütiger Blockierung mit 1 % BSA/PBS wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit 1 % BSA/PBS inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit sekundären Antikörpern und DAPI. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Mikroskop (Keyence) oder einem BX50 (Olympus) aufgenommen. Pax6-, Tbr2- oder pHH3-positive Zellen in 250 μm breiter CA oder 100 μm breiter DG wurden mit der ImageJ-Software analysiert. Quantitative Analysen wurden blind für den Genotyp durchgeführt. Grundsätzlich wurden zwei Abschnitte pro Tier analysiert. Für die β-Galactosidase-Färbung wurden 20 μm dicke sagittale Schnitte mit PBS gespült, permeabilisiert und mit 0,1 % Triton X-100/5 % NDS/PBS 20 Minuten lang blockiert. Die Schnitte wurden mit Anti-β-Galactosidase und Anti-NeuN- oder GFAP-Antikörpern in 0,1 % Triton X-100/1 % NDS/PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 1 Stunde lang mit Sekundärantikörpern und DAPI inkubiert. Die Bilder wurden mit FV1200 (Olympus) aufgenommen.

Koronale Schnitte (4 μm dick) bei Bregma –0,35 mm, die auf Objektträgern platziert wurden, wurden nacheinander in Xylol (dreimal für 5 Minuten), 100 % Ethanol (dreimal für 3 Minuten) und 95 % Ethanol (5 Minuten) eingeweicht. Anschließend wurden die Schnitte mit 0,1 % Luxol Fast Blue/95 % Ethanol über Nacht bei 50 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit Wasser wurden die Schnitte 5 Sekunden lang in 0,05 % Lithiumcarbonat eingeweicht, wie oben dehydriert und mit 0,1 % Kristallviolett (Sigma, C5042) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Mikroskop (Keyence) aufgenommen und mit der ImageJ-Software analysiert.

Kurz gesagt wurden im OCT eingebettete Gehirne in der Koronarebene mit einer Dicke von 50 μm geschnitten und die Schnitte auf Platten mit 24 Vertiefungen in PBS übertragen. Die Scheiben wurden gründlich mit PBS gespült und mit 0,1 % Triton X-100/PBS 20 Minuten lang permeabilisiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 60 Minuten lang in Neurotrace 530/615 (1:200; Thermo Fisher Scientific; N21482) inkubiert und mit PBS gespült. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Mikroskop (Keyence) aufgenommen.

Isolierte Mäusehirne wurden in kaltem Homogenatpuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,32 M Saccharose, 1 mM EDTA und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid mit Proteaseinhibitor-Cocktail) unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Nach Zugabe einer gleichen Menge Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid mit Protease). Inhibitorcocktail) wurden die Lysate 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und 15 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden mit dem Probenpuffer gemischt, 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, einer SDS-PAGE unterzogen und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen geblottet. Nach dem Blockieren mit 5 % Magermilch/TBST (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl und 0,05 % Tween-20) wurden die Membranen mit primären und sekundären Antikörpern in 1 % Magermilch/TBST inkubiert. Die Intensitäten der immunreaktiven Banden wurden mit ImageQuant TL (GE Healthcare) quantifiziert.

Hippocampi wurden aus E18.5-Mausembryonen präpariert, 30 Minuten lang bei 30 °C mit 0,15 % Trypsin (Gibco) und 0,1 % Kollagenase (Wako) behandelt und dann vorsichtig verrieben. Um die Längen der Axone und Neuriten zu messen, wurden 2 × 104 Zellen (für Neuritenlängen) oder 6 × 104 Zellen (für die Contactin-2-Intensität) auf Poly-L-Lysin-beschichteten 3,5-cm-Schalen (für Neuriten) ausplattiert Längen) oder Deckgläser in 3,5-cm-Schalen (für Contactin-2-Intensität) und kultiviert in einem neurobasalen Medium (Gibco, 21103049), ergänzt mit 2 % B27 (Gibco, 17504001) und 0,5 mM Glutamin (Sigma-Aldrich) für DIV 3 oder DIV 2. Um die Neuritenlänge zu messen, wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % PFA/PBS fixiert, 15 Minuten lang mit 0,1 % Triton-100/PBS permeabilisiert, 1 Stunde lang mit 5 % NDS/PBS blockiert und mit einem Anti inkubiert -phosphorylierter Neurofilament-Antikörper [SMI-31] und Rhodamin-konjugiertes Phalloidin (Thermo Fisher Scientific, R415) über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang mit einem sekundären Antikörper und DAPI inkubiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen FV1000-Mikroskop (Olympus) aufgenommen. Die Axonlänge (phosphorylierte Neurofilament-positive Neuriten) und die Gesamtneuritenlänge (Rhodamin-konjugierte Phalloidin-positive Neuriten) wurden mit der ImageJ-Software gemessen. Zur Contactin-2-Färbung wurden die Zellen 15 Minuten lang mit 4 % PFA/PBS fixiert, 15 Minuten lang mit 0,05 % Saponin/PBS permeabilisiert, 1 Stunde lang mit 5 % NGS/PBS blockiert und mit einem Anti-Contactin-2 inkubiert Antikörper und Rhodamin-konjugiertes Phalloidin über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang mit einem sekundären Antikörper und DAPI inkubiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen FV1200-Mikroskop (Olympus) aufgenommen. Um exogenes GFP und GFP-RAB35 zu exprimieren, wurden 8 × 104 Zellen mit pcDNA3.1-GFP- oder GFP-RAB35-Plasmiden bei DIV 1 unter Verwendung von HilyMax (DOJINDO) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert und bei DIV 3 fixiert. Quantifizierung der Contactin-2-Intensität an der somatischen Plasmamembran wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Verhaltenstests wurden mit den männlichen Wurfgeschwistern der Kontrolle (Rab35flox/+; Nestin-Cre) und Rab35 cKO (Rab35flox/flox; Nestin-Cre) im Alter von 12–18 Wochen während der Lichtperiode des 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus durchgeführt . Vor einer Reihe von Verhaltenstests wurden die Mäuse 4–5 Tage lang 5 Minuten pro Tag behandelt und vor jedem Test mindestens 30 Minuten lang an den Testraum gewöhnt. Verhaltenstests wurden von einem Experimentator durchgeführt, der für den Genotyp blind war. Beim Freifeldtest wurde jede Maus in eine Ecke des Freifeldgeräts, bestehend aus weißem PVC (50 × 50 × 40 cm, Breite × Tiefe × Höhe; O’Hara & Co.) gestellt und mit 70 Lux beleuchtet. und durfte sich 15 Minuten lang frei bewegen. Die Daten wurden mit der Time OFCR1-Software (O'Hara & Co.) aufgezeichnet und analysiert. Der erhöhte Plus-Labyrinth-Apparat (O'Hara & Co.) bestand aus zwei offenen Armen und zwei geschlossenen Armen (jeweils 25 × 5,5 cm) mit 15 cm hohen transparenten Wänden. Das Labyrinth wurde 50 cm über dem Boden platziert und mit 70 Lux beleuchtet. Jede Maus wurde mit offenem Arm in die Mitte des Labyrinths gestellt und durfte sich 10 Minuten lang frei im Labyrinth bewegen. Die Daten wurden mit der ImageJ EP1-Software (O'Hara & Co.) aufgezeichnet und analysiert. Beim Rotarod-Test wurden Mäuse auf einen Stab (O'Hara & Co.) gesetzt, der sich mit 4 U/min drehte. Die Rotationsgeschwindigkeit wurde über einen Zeitraum von 300 s von 4 auf 40 U/min beschleunigt. Die Mäuse wurden in drei Versuchen pro Tag mit einem Abstand von 1,5 Stunden zwischen den Versuchen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen trainiert. Gemessen wurde der Zeitpunkt, zu dem eine Maus von der Rute fiel. Der erhöhte Plus-Labyrinth-Apparat (O'Hara & Co.) bestand aus zwei offenen Armen und zwei geschlossenen Armen (jeweils 25 × 5,5 cm) mit 15 cm hohen transparenten Wänden. Das Labyrinth wurde 50 cm über dem Boden platziert und mit 70 Lux beleuchtet. Jede Maus wurde in der Mitte des Labyrinths mit dem Gesicht zu einem offenen Arm platziert und konnte sich 10 Minuten lang frei bewegen. Die Daten wurden mit der ImageJ EP1-Software (O'Hara & Co.) aufgezeichnet und analysiert. Der Y-Labyrinthapparat bestand aus drei undurchsichtigen Armen und wurde mit 70 Lux beleuchtet. Jede Maus wurde am Ende eines Arms platziert und konnte sich während einer 8-minütigen Sitzung frei bewegen. Der Prozentsatz der spontanen Wechsel wurde wie folgt berechnet:

Die Daten wurden mit der Time YM1-Software (O'Hara & Co.) aufgezeichnet und analysiert. Der Barnes-Labyrinthapparat (O'Hara & Co.) ist eine kreisförmige Plattform (1 m Durchmesser) mit 16 gleichmäßig verteilten Löchern entlang des Umfangs, die 75 cm über dem Boden liegt. Unter einem der Löcher befand sich eine schwarze Fluchtbox, die das Ziel darstellte. Das Zielloch (Fluchtloch) war für jede Maus gleich, wurde jedoch zwischen den Mäusen randomisiert. Die Beleuchtung wurde auf 200 Lux gehalten. Während der Trainingsphase und des Sondentests wurden vier räumliche Hinweise mit unterschiedlichen Farben und Formen an den Wänden des Testraums aufgehängt, jedoch nicht während der Gewöhnungsphase. Während der Gewöhnung (Tag 1) wurde jede Maus in eine undurchsichtige zylindrische Startkammer in der Mitte des Labyrinths gesetzt. Nach 10 Sekunden konnte die Maus das Labyrinth 3 Minuten lang frei erkunden und wurde dann vorsichtig zur Fluchtbox geführt. Während der Erfassungsversuche (Tage 2–5) durfte jede Maus 10 Sekunden nach dem Einsetzen in die Startkammer das Labyrinth pro Versuch 3 Minuten lang frei erkunden. Jede Maus erhielt drei Versuche mit einem Abstand von 15 Minuten zwischen den Versuchen an vier aufeinanderfolgenden Tagen. Die Versuche endeten, wenn die Maus das Zielloch betrat oder wenn die 3 Minuten abgelaufen waren. Mäuse, die die Fluchtbox nicht betraten, wurden vorsichtig zum Zielloch geführt und verbrachten dort 1 Minute. Während des Sondentests (Tag 6) erkundete jede Maus 3 Minuten lang frei das Labyrinth ohne Fluchtbox. Die Daten wurden mit der Time BCM-Software (O'Hara & Co.) aufgezeichnet und analysiert. Beim Sondentest wurden 90 Sekunden lang 3-Minuten-Daten zur Analyse verwendet.

Schwangeren Mäusen wurden bei E14,5 intraperitoneal 50 mg/kg Körpergewicht 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU; Thermo Fisher Scientific, A10044) injiziert. Die Gehirne der P12-Wurfgeschwister wurden isoliert und über Nacht in 4 % PFA/PBS bei 4 °C fixiert, über Nacht in 30 % Saccharose/PBS bei 4 °C dehydriert, in die OCT-Verbindung eingebettet und in einer Dicke von 20 μm kryogeschnitten. Die EdU-Erkennung wurde mithilfe eines Click-it EdU Alexa 594 Imaging Kit-Protokolls (Thermo Fisher Scientific, C10339) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Mikroskop (Keyence) aufgenommen. Zur Quantifizierung wurden der Hippocampus (400 μm Breite) und der Kortex (500 μm Breite) in fünf oder zehn gleiche Behälter aufgeteilt und die Anzahl der EdU-positiven Zellen quantifiziert. Grundsätzlich wurden zwei Schnitte pro Tier mit der ImageJ-Software analysiert.

Die Hippocampi der Kontroll- (Rab35flox/+; Nestin-Cre) und Rab35 cKO-Mäusegruppen bei P0 (n = 5 biologische Replikate pro Genotyp) wurden in einem Puffer lysiert, der 6 M Guanidinhydrochlorid und 100 mM HEPES-NaOH (pH 8,0) enthielt. , 10 mM TCEP und 40 mM Chloracetamid. Die Lysate wurden durch Erhitzen und Ultraschallbehandlung aufgelöst, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 15.000 U/min bei 4 °C. Proteine ​​(jeweils 100 µg) wurden mittels Methanol/Chloroform-Fällung gereinigt und durch Zugabe von 20 µL 0,1 % RapiGest SF (Waters) in 50 mM Triethylammoniumbicarbonat solubilisiert. Nach wiederholter Ultraschallbehandlung und Vortexen wurden die Proteine ​​mit 1 µg Trypsin/Lys-C-Mischung (Promega) 16 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Die Peptidkonzentrationen wurden unter Verwendung des quantitativen kolorimetrischen Peptidassays nach Pierce (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Ungefähr 25 µg Peptide für jede Probe wurden mit 0,2 mg TMT10-Plex-Reagenzien (Thermo Fisher Scientific) 1 Stunde lang bei 25 °C markiert. Nachdem die Reaktion mit Hydroxylamin gelöscht wurde, wurden alle TMT-markierten Proben gepoolt, mit Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert und unter Verwendung des Pierce-Umkehrphasen-Peptidfraktionierungskits mit hohem pH-Wert (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers fraktioniert. Neun Fraktionen wurden unter Verwendung von 5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25 und 80 % Acetonitril (ACN) gesammelt. Jede Fraktion wurde in einem SpeedVac-Konzentrator eingedampft und in 0,1 % TFA und 3 % ACN gelöst.

Die LC-MS/MS-Analyse der resultierenden Peptide (jeweils 1 µg) wurde auf einem EASY-nLC 1200 UHPLC durchgeführt, der über eine Nanoelektrospray-Ionenquelle (Thermo Fisher Scientific) mit einem Q Exactive Plus-Massenspektrometer verbunden war. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten von 4–20 % ACN für min. 0–180 und 20–32 % ACN für min. 180–220 getrennt, gefolgt von einem Anstieg auf 80 % ACN für min. 220–230. Das Massenspektrometer wurde in einem datenabhängigen Erfassungsmodus mit einer Top-15-MS/MS-Methode betrieben. MS1-Spektren wurden mit einer Auflösung von 70.000, einem automatischen Verstärkungskontrollziel (AGC) von 3 × 106 und einem Massenbereich von 375–1400 m/z gemessen. HCD-MS/MS-Spektren wurden mit einer Auflösung von 35.000, einem AGC-Ziel von 1 × 105, einem Isolationsfenster von 0,4 m/z, einer maximalen Injektionszeit von 100 ms und einer normalisierten Kollisionsenergie von 34 aufgenommen. Es wurde ein dynamischer Ausschluss festgelegt bis 30 s. Die Rohdaten wurden zur Identifizierung und TMT-Quantifizierung direkt anhand der auf M. musculus beschränkten SwissProt-Datenbank unter Verwendung von Proteome Discoverer Version 2.3 (Thermo Fisher Scientific) mit der Mascot-Suchmaschine Version 2.5 (Matrix Science) analysiert. Die Suchparameter waren wie folgt: (a) Trypsin als Enzym mit bis zu zwei fehlenden Spaltungen; (b) Vorläufer-Massentoleranz von 10 ppm; (c) Fragmentmassentoleranz von 0,02 Da; (d) TMT des Lysin- und Peptid-N-Terminus und Carbamidomethylierung von Cystein als feste Modifikationen; und (e) Oxidation von Methionin als variable Modifikation. Peptide wurden mithilfe des Perkolatorknotens mit einer Falscherkennungsrate (FDR) von 1 % gefiltert.

Zur Quantifizierung von Contactin-2 und CHL1 wurden mindestens drei Peptide/Proteine ​​mithilfe von PRM gemessen, einer MS/MS-basierten gezielten Quantifizierungsmethode unter Verwendung hochauflösender MS. Gezielte MS/MS-Scans wurden durch eine zeitgesteuerte Einschlussliste mit einer Auflösung von 70.000, einem AGC-Ziel von 2 × 105, einem Isolationsfenster von 4,0 m/z, einer maximalen Injektionszeit von 500 ms und einer normalisierten Kollisionsenergie erfasst von 27. Zeitausrichtung und relative Quantifizierung der Übergänge wurden mit PinPoint Version 1.4 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software) und EZR-Software54 durchgeführt. Die Stichprobengrößen wurden auf der Grundlage früherer Studien mit ähnlichen Experimenten bestimmt. Die Experimentatoren waren während der Erfassung von Bilddaten, Quantifizierung und Verhaltenstests blind. Die Daten, einschließlich der Umrisse, wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität überprüft und die Varianzgleichheit wurde mit dem F-Test überprüft. Die Mittelwerte zwischen den beiden Gruppen wurden mithilfe eines parametrischen Tests (zweiseitiger ungepaarter Student-T-Test oder Welch-T-Test) oder eines nichtparametrischen Tests (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) verglichen. Die Mittelwerte zwischen den drei Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA verglichen. Daten aus mehreren Gruppen wurden mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Mehrfachvergleichstests analysiert. In den Punktdiagrammen stellen die Balken den Mittelwert ± SEM dar. In den Box- und Whisker-Plots stellen die Boxen den Interquartilbereich (25. bis 75. Perzentil) dar und die Balken in den Boxen stellen den Median dar. Die Whisker decken den Bereich vom Minimum bis zum Maximum ab. Die Punkte in den Diagrammen zeigen einzelne Datenpunkte. Einzelne Informationen zur Stichprobengröße und zu statistischen Tests sind in den Legenden der Abbildungen beschrieben. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt. Alle Experimente mit Ausnahme des Western-Blot-Experiments mit E13.5-Gehirnen und der Proteomanalyse wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in diesen Ergebnissen dargestellten Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich. Die Proteomikdaten dieser Studie wurden in jPOST hinterlegt. Die Zugangsnummern lauten PXD041290 für ProteomeXchange und JPST002112 für jPOST. Die ursprünglichen, nicht zugeschnittenen Blots und PCR-Bilder finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 3, 4. Quelldaten für die Grafiken finden Sie in den Zusatzdaten 2.

Zhen, Y. & Stenmark, H. Zelluläre Funktionen von Rab-GTPasen auf einen Blick. J Cell Sci. 128, 3171–3176 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Kouranti, I., Sachse, M., Arouche, N., Goud, B. & Echard, A. Rab35 reguliert einen endozytischen Recyclingweg, der für die Endschritte der Zytokinese wesentlich ist. Curr Biol. 16, 1719–1725 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chesneau, L. et al. Eine ARF6/Rab35-GTPase-Kaskade für endozytisches Recycling und erfolgreiche Zytokinese. Curr Biol. 22, 147–153 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sato, M. et al. Regulierung des endozytischen Recyclings durch C. elegans Rab35 und seinen Regulator RME-4, ein Coated-Pit-Protein. EMBO J. 27, 1183–1196 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haley, R., Wang, Y. & Zhou, Z. Die kleine GTPase RAB-35 definiert einen dritten Weg, der für die Erkennung und den Abbau apoptotischer Zellen erforderlich ist. PLoS Genet. 14, e1007558 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kutscher, LM, Keil, W. & Shaham, S. RAB-35- und ARF-6-GTPasen vermitteln die Verschlingung und Clearance nach dem Tod des Linkerzelltyps. Entwicklerzelle. 47, 222–238.e226 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J., Fonovic, M., Suyama, K., Bogyo, M. & Scott, MP Rab35 kontrolliert die Aktinbündelung durch die Rekrutierung von Fascin als Effektorprotein. Wissenschaft. 325, 1250–1254 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shim, J. et al. Rab35 vermittelt den Transport von Cdc42 und Rac1 zur Plasmamembran während der Phagozytose. Mol Zellbiol. 30, 1421–1433 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uytterhoeven, V., Kuenen, S., Kasprowicz, J., Miskiewicz, K. & Verstreken, P. Der Verlust von Skywalker zeigt synaptische Endosomen als Sortierstationen für synaptische Vesikelproteine. Zelle. 145, 117–132 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brantley, SE & Fuller, MT Somatische Stützzellen regulieren das Überleben der Keimzellen durch den Baz/aPKC/Par6-Komplex. Entwicklung. 146, dev169342 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsu, C. et al. Regulierung der Exosomensekretion durch Rab35 und seine GTPase-aktivierenden Proteine ​​TBC1D10A-C. J Cell Biol. 189, 223–232 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cauvin, C. et al. Rab35-GTPase löst eine schalterartige Rekrutierung der Lowe-Syndrom-Lipidphosphatase OCRL auf neugeborenen Endosomen aus. Curr Biol. 26, 120–128 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Minowa-Nozawa, A., Nozawa, T., Okamoto-Furuta, K., Kohda, H. & Nakagawa, I. Rab35 GTPase rekrutiert NDP52 für Autophagieziele. EMBO J. 36, 2790–2807 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Patino-Lopez, G. et al. Rab35 und sein GAP EPI64C in T-Zellen regulieren das Rezeptorrecycling und die immunologische Synapsenbildung. J. Biol. Chem. 283, 18323–18330 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chevallier, J. et al. Rab35 reguliert das Neuritenwachstum und die Zellform. FEBS Lett. 583, 1096–1101 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Allaire, PD et al. Das Zusammenspiel zwischen Rab35 und Arf6 steuert das Ladungsrecycling, um die Zelladhäsion und -migration zu koordinieren. J. Cell Sci. 126, 722–731 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Charrasse, S., Comunale, F., De Rossi, S., Echard, A. & Gauthier-Rouviere, C. Rab35 reguliert die Cadherin-vermittelte Bildung von Adherens-Verbindungen und die Myoblastenfusion. Mol. Biol. Zelle 24, 234–245.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuhns, S. et al. Rab35 steuert die Länge, Funktion und Membranzusammensetzung des Ciliums. EMBO Rep. 20, e47625 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kanno, E. et al. Umfassendes Screening auf neuartige Rab-bindende Proteine ​​mittels GST-Pulldown-Assay unter Verwendung von 60 verschiedenen Säugetier-Rabs. Verkehr. 11, 491–507 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miyamoto, Y., Yamamori, N., Torii, T., Tanoue, A. & Yamauchi, J. Rab35 reguliert durch ACAP2, das Arf6 ausschaltet, die Differenzierung und Myelinisierung von Oligodendrozyten negativ. Mol. Biol. Zelle 25, 1532–1542 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheehan, P., Zhu, M., Beskow, A., Vollmer, C. & Waites, CL Der aktivitätsabhängige Abbau synaptischer Vesikelproteine ​​erfordert Rab35 und den ESCRT-Weg. J. Neurosci. 36, 8668–8686 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Villarroel-Campos, D. et al. Die Rab35-Funktionen bei der Axonverlängerung werden durch die P53-verwandte Proteinkinase in einem Mechanismus reguliert, der den Abbau des Rab35-Proteins und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1B beinhaltet. J. Neurosci. 36, 7298–7313 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chiu, CC et al. Eine erhöhte Rab35-Expression ist ein potenzieller Biomarker und an der Pathogenese der Parkinson-Krankheit beteiligt. Oncotarget. 7, 54215–54227 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vaz-Silva, J. et al. Endolysosomaler Abbau von Tau und seine Rolle bei Glukokortikoid-bedingter Fehlfunktion des Hippocampus. EMBO J. 37, e99084 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wheeler, DB, Zoncu, R., Root, DE, Sabatini, DM & Sawyers, CL Identifizierung eines onkogenen RAB-Proteins. Wissenschaft. 350, 211–217 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rakic, P. Evolution des Neocortex: eine Perspektive aus der Entwicklungsbiologie. Nat. Rev. Neurosci. 10, 724–735 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hayashi, K., Kubo, K., Kitazawa, A. & Nakajima, K. Zelluläre Dynamik der neuronalen Migration im Hippocampus. Vorderseite. Neurosci. 9, 135 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchsbaum, IY & Cappello, S. Neuronale Migration im ZNS während der Entwicklung und Krankheit: Erkenntnisse aus In-vivo- und In-vitro-Modellen. Entwicklung. 146, dev163766 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Silva, CG, Peyre, E. & Nguyen, L. Die Zellmigration fördert dynamische zelluläre Interaktionen, um die Morphogenese der Großhirnrinde zu kontrollieren. Nat. Rev. Neurosci. 20, 318–329 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawauchi, T. et al. Rab-GTPasen-abhängige endozytische Signalwege regulieren die neuronale Migration und Reifung durch N-Cadherin-Transport. Neuron 67, 588–602 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, Q. et al. RAB18, ein Protein, das mit dem Warburg-Mikro-Syndrom assoziiert ist, steuert die neuronale Migration in der sich entwickelnden Großhirnrinde. Mol. Gehirn 9, 19 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hor, CHH & Goh, ELK Rab23 reguliert die radiale Migration von Projektionsneuronen über N-Cadherin. Großhirn. Cortex 28, 1516–1531 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tronche, F. et al. Eine Störung des Glukokortikoidrezeptor-Gens im Nervensystem führt zu einer Verringerung der Angst. Nat. Genet. 23, 99–103 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kriegstein, A. & Alvarez-Buylla, A. Die Glia-Natur embryonaler und adulter neuronaler Stammzellen. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149–184 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, T. & Hevner, RF Wachstum und Faltung der Großhirnrinde von Säugetieren: von Molekülen zu Fehlbildungen. Nat. Rev. Neurosci. 15, 217–232 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ayala, R., Shu, T. & Tsai, LH Trekking durch das Gehirn: die Reise der neuronalen Migration. Zelle 128, 29–43 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marin, O., Valiente, M., Ge, X. & Tsai, LH Steuerung neuronaler Zellmigrationen. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. 2, a001834 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Belvindrah, R., Nosten-Bertrand, M. & Francis, F. Neuronale Migration und ihre Störungen, die die CA3-Region betreffen. Vorderseite. Zellneurosci. 8, 63 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamura, N. et al. Lieferung von Endosomen an Lysosomen mittels Mikroautophagie im viszeralen Endoderm von Mäuseembryonen. Nat. Komm. 3, 1071 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Kawamura, N. et al. Die Rab7-vermittelte Endozytose führt durch die Inaktivierung des Dkk-Antagonismus zu einer Strukturierung der Wnt-Aktivität. Cell Rep. 31, 107733 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kobayashi, H. & Fukuda, M. Arf6, Rab11 und Transferrinrezeptor definieren unterschiedliche Populationen von Recycling-Endosomen. Komm. Integr. Biol. 6, e25036 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kobayashi, H. & Fukuda, M. Rab35 reguliert die Arf6-Aktivität durch Centaurin-beta2 (ACAP2) während des Neuritenwachstums. J. Cell Sci. 125, 2235–2243 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Demyanenko, GP et al. Ein enges Homolog von L1 moduliert die gebietsspezifische neuronale Positionierung und Dendritenorientierung in der Großhirnrinde. Neuron 44, 423–437 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jakovcevski, I. et al. Ein enges Homolog des Adhäsionsmoleküls L1 fördert das Überleben von Purkinje- und Körnerzellen sowie die Migration von Körnerzellen während der Kleinhirnentwicklung der Maus. J. Comp. Neurol. 513, 496–510 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Katic, J. et al. Die Wechselwirkung des Zelladhäsionsmoleküls CHL1 mit Vitronektin, Integrinen und dem Plasminogenaktivator-Inhibitor-2 fördert das CHL1-induzierte Neuritenwachstum und die neuronale Migration. J. Neurosci. 34, 14606–14623 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Buhusi, M. et al. Ein enges Homolog von L1 ist ein Verstärker der Integrin-vermittelten Zellmigration. J. Biol. Chem. 278, 25024–25031 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schlatter, MC, Buhusi, M., Wright, AG & Maness, PF CHL1 fördert den Sema3A-induzierten Wachstumskegelkollaps und die Neuritenentwicklung durch ein Motiv, das für die Rekrutierung von ERM-Proteinen an der Plasmamembran erforderlich ist. J. Neurochem. 104, 731–744 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Kishimoto, T. et al. Eine Herunterregulierung von L1 stört die neuronale Migration und verändert die Expression von Transkriptionsfaktoren im murinen Neocortex. J. Neurosci. Res. 91, 42–50 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mestres, I., Chuang, JZ, Calegari, F., Conde, C. & Sung, CH SARA reguliert die neuronale Migration während der neokortikalen Entwicklung durch L1-Handel. Entwicklung 143, 3143–3153 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Denaxa, M., Chan, CH, Schachner, M., Parnavelas, JG & Karagogeos, D. Das Adhäsionsmolekül TAG-1 vermittelt die Migration kortikaler Interneurone von der ganglionären Eminenz entlang des kortikofugalen Fasersystems. Entwicklung 128, 4635–4644 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kyriakopoulou, K., de Diego, I., Wassef, M. & Karagogeos, D. Eine Kombination aus Ketten- und neurophiler Migration, an der das Adhäsionsmolekül TAG-1 im Schwanzmark beteiligt ist. Entwicklung 129, 287–296 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Malhotra, JD, Tsiotra, P., Karagogeos, D. & Hortsch, M. Cis-Aktivierung der L1-vermittelten Ankyrin-Rekrutierung durch TAG-1 homophile Zelladhäsion. J. Biol. Chem. 273, 33354–33359 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sato, T. et al. Die Rab8-GTPase reguliert die apikale Proteinlokalisierung in Darmzellen. Natur 448, 366–369 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kanda, Y. Untersuchung der frei verfügbaren, einfach zu bedienenden Software „EZR“ für medizinische Statistiken. Knochenmarktransplantation. 48, 452–458 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken allen Mitgliedern des Sato-Labors für ihre freundliche Unterstützung und hilfreiche Diskussion. Wir danken auch Dr. Hideaki Miwa, Yuchio Yanagawa (Gunma University) und Akiko Hayashi-Takagi (RIKEN) für ihre Vorschläge zu Verhaltenstests bei Mäusen; Dr. Masatoshi Nomura (Universität Kurume) und Dr. Akihiro Harada und Masataka Kunii (Universität Osaka) für die Generierung von Knockout-Mauslinien; und Frau Megumi Kawano (Universität Tokushima) für ihre technische Unterstützung für LC-MS/MS. Diese Arbeit wurde vom JSPS KAKENHI unterstützt (Zuschussnummern 16J11714, 19J40272 und 23K05678 an IM); und die gemeinsamen Nutzungs- und Forschungsprogramme des Institute of Advanced Medical Sciences der Universität Tokushima an KS. Diese Arbeit wurde auch von JSPS KAKENHI (17H03669, 19H05711 und 20H00466) und der Takeda Science Foundation an KS unterstützt

Labor für molekularen Verkehr, Institut für molekulare und zelluläre Regulation, Universität Gunma, Maebashi, Gunma, 371-8512, Japan

Ikuko Maejima, Tomoko Akuzawa, Rika Hirai, Hisae Kobayashi, Inoya Isobe und Ken Sato

Labor für Lebensmittel- und Biowissenschaften, Fakultät für Humanwissenschaften, Waseda-Universität, Tokorozawa, Saitama, 359-1192, Japan

Taichi Hara

Abteilung für Labortier- und Genomwissenschaften, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology, Chiba, Chiba, 263-8555, Japan

Satoshi Tsukamoto

Abteilung für Biowissenschaften, School of Science, Universität Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japan

Hiroyuki Koizumi & Kazuo Emoto

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Ohu-Universität, Koriyama, Fukushima, 963-8611, Japan

Hiroyuki Koizumi

Abteilung für adaptive und maladaptive Reaktionen in Gesundheit und Krankheiten, Graduate School of Medicine, Universität Kyoto, Kyoto, 606-8507, Japan

Takeshi Kawauchi

Abteilung für Zellsignalisierung, Fujii Memorial Institute of Medical Sciences, Universität Tokushima, Tokushima, Tokushima, 770-8503, Japan

Hidetaka Kosako

Gunma University Initiative for Advanced Research (GIAR), Gunma University, Maebashi, Gunma, 371-8512, Japan

Ken Sato

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

KS, TH und IM haben die Experimente entworfen. IM charakterisierte die Rab35-Knockout-Mauslinien. KE, TK und H. Koizumi überwachten die Migrationsexperimente. TA und II führten die immunhistochemischen Experimente durch. RH und IM führten die Experimente mit primären Neuronen durch. TH, ST und H. Kobayashi erzeugten die Knockout-Mauslinien. H. Kosako überwachte und führte die massenspektrometrischen Experimente durch. KS und TH betreuten das Projekt. IM und KS haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Ken Sato.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Christian Gonzalez-Billault und Emilie Pacary für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Edwina McGlinn und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Maejima, I., Hara, T., Tsukamoto, S. et al. RAB35 ist für die Entwicklung und Funktion des murinen Hippocampus durch Regulierung der neuronalen Zellverteilung erforderlich. Commun Biol 6, 440 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04826-x

Zitat herunterladen

Eingegangen: 03. September 2021

Angenommen: 07. April 2023

Veröffentlicht: 21. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04826-x

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.